作者：
Xiaolin Shi a, Zhitao Zhang a, David S. Cram b,*, Caixia Liu a,**
a中国医科大学附属盛京医院妇产科，辽宁沈阳，中国
b北京贝瑞和康生物技术有限公司，北京，中国
*共同通讯作者，**通讯作者
摘要：
背景: 非侵入性产前检测(NIPT)运用大 规 模 平 行 测 序 技 术(MPS)检测妊娠中期外周血胎儿游离DNA(cffDNA)，现已作为常见胎儿染色体疾病的一线检测技术加以运用。若在妊娠早期知晓NIPT检测结果，对于高危妊娠人群的临床管理更为有利。本研究旨在验证NIPT用于妊娠早期胎儿染色体疾病检测的可行性。
方法：构建用于MPS的血浆DNA文库，以参考基因组为参照进行染色体片段的标准化，基于z值大小确认样本是否为染色体非整倍体（正常值为-3
结论：NIPT用于妊娠早期常见胎儿染色体非整倍体的检测，高度可靠且准确，但由于少数孕妇cffDNA含量过低，因而临床应用仍需谨慎。
关键词：妊娠早期、胎儿染色体非整倍体、非侵入性产前检测、胎儿游离DNA
背景
非侵入性产前检测（Non-invasive Prenatal Diagnosis Testing，NIPT）运用大 规 模 平 行 测 序 技 术(Massively Parallel Sequencing，MPS)检测外周血胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，现已作为常见胎儿染色体疾病（如T21、T18、T13和性染色体非整倍体）的一线检测方法[1,2]加以运用。前瞻性临床研究表明[3–6]，NIPT对T21、T18和T13具有很高的检测灵敏度和特异性，假阳性率和假阴性率低于0.1%。NIPT现已作为高危和低危孕妇妊娠中期的常规检测，偶用于早至10孕周的妊娠早期检测[2,7]。
cffDNA主要来源于胎盘细胞[8,9]，其含量高低影响NIPT的检测精度。绝大多数情况下，NIPT可对cffDNA检测阈值（约4%）以上的样本实现精确检测。妊娠中期的cffDNA平均含量为10–21%，并以每周约1%速度递增[10,11]。孕期体重增加[10,12,13]、孕龄增加[10,12]、多胎妊娠[14,15]和先兆子痫[11,16] 是导致cffDNA含量较高的主要因素。此外，T21胎儿[17]、体能锻炼[18]、多种胎儿特征[13]和不良妊娠结局[11]等次要因素也参与调节cffDNA含量。不过上述所有因素均不能用于预测cffDNA含量，揭示存在其它因素参与胎儿及母亲的最终外周血DNA比例调节[11]。
NIPT对妊娠早期进行检测，利于高危孕妇且能缓解孕妇等待妊娠中期检测结果的焦虑。本研究旨在评估NIPT用于妊娠早期的可行性。共有182名妊娠早期（8-12孕周）和妊娠中期（15-18孕周）的高危孕妇参与本次研究。研究结果显示，NIPT对于妊娠早期低水平的cffDNA仍具有较好的检测可靠性和精确性。不过与现有理论相悖的是，本研究首次揭示单个患者的cffDNA含量也可能出现较大波动。从妊娠早期至中期，cffDNA含量既可能升高，又可能降低，或维持不变。
方法
试验设计
本研究已取得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。共209名高危孕妇参加本研究，包括高龄和（或）有流产史的孕妇。所有接受NIPT检测的孕妇均需签署知情同意书，并分别于妊娠早期（8-11+6孕周）和中期（15-18孕周）采集外周血样本。NIPT阳性孕妇需在15-20孕周接受羊膜腔穿刺术和核型分析。
样本采集和处理
使用Streck真空采血管抽取10ml外周血，并于48h内进行血浆分离：将Streck真空采血管以1600×g 离心10min。随后，转移血浆层至微量离心管，并以16000×g再次离心10min。小心转移血浆样品至另一支微量离心管。纯化的血浆样品-20℃保存。
NIPT
利用QIAamp血液DNA提取试剂盒（Qiagen公司）提取每份样本的血浆DNA。带有序列标签的接头引物用于构建血浆DNA文库。利用Illumina Hiseq2000平台进行MPS。根据已发表文献方法进行数据分析[3,19]。通过z值（正常值：-3<< span="">z<3< span="">）确定胎儿的染色体是否存在染色体非整倍体。如前所述，根据Y染色体序列片段所占比例，计算所有男性胎儿的游离DNA含量[20]。
结果
NIPT检测妊娠早期及中期样本
209名高危孕妇参加本研究并进行妊娠早期NIPT检测。NIPT检出9例染色体非整倍体，包括4例T21、4例T13和1例45,X（表1）。其中3例T21和3例T13后续流产。由于未采集到任何流产组织，因而未能确认相应的NIPT检测结果。在剩余的203名孕妇中，21名后续失访。因而总共182名孕妇进行妊娠中期NIPT检测，检测出1例T21、1例T13和1例45,X，而其余孕妇NIPT检测结果正常。
NIPT妊娠中期的检测结果与妊娠早期一致（表1），且经后续的羊膜腔穿刺术和核型分析确认。故而该3名孕妇后续选择终止妊娠。在妊娠早期NIPT检测结果正常的179名孕妇中，178名妊娠中期NIPT结果也正常，提示NIPT对于T21、T13和45,X的检测灵敏度和特异性接近100%。剩余1名孕妇在妊娠中期采样前已流产。随后对流产组织进行CNV-seq分析，确认为T15（图1）。重新对该患者的NIPT结果进行分析，发现15号染色体的z值在正常范围内（表1），为NIPT假阴性样本。
妊娠早期和中期的cffDNA含量分析
在重复进行NIPT检测的181名孕妇中，96名（53%）怀有男性胎儿，分析这些孕妇在妊娠早期和中期的cffDNA含量变化趋势。发现妊娠早期cffDNA的平均含量为7.6±4.18%，范围区间为2.56–21.03%（图2A）。随孕龄增加，妊娠第51–84天cffDNA含量轻微上升（R2=0.109，P<0.001< span="">）。值得注意的是，15名（15.6%）孕妇妊娠早期的cffDNA含量低于NIPT检测阈值4% [3,19]，且孕龄随机分布。妊娠中期cffDNA平均含量为10.47±4.70%，范围区间为3.93–31.45%。95名（99%）孕妇的cffDNA含量高于4%（图2B）。随孕龄增加，妊娠中期cffDNA含量稍有上升（R2=0.005），但无统计学差异（P=0.48），怀疑由于样本采集时间过于集中（第105–120天）导致。综上所述，妊娠中期cffDNA平均含量高于妊娠早期，两者差异未显示统计学意义（P>0.05）。
cffDNA含量在妊娠早期和中期的差异比较
在NIPT分析96名怀有男性胎儿孕妇在妊娠早期和中期cffDNA含量的基础上，本研究进一步分析单一孕妇cffDNA含量的动态变化趋势（图3）。以1% cffDNA含量变动为参考，57名孕妇（59%）cffDNA含量上升，16名孕妇（17%）cffDNA含量不变，23名孕妇（24%）cffDNA含量下降。在cffDNA含量下降的23名孕妇中，78%降幅超过3%。有趣的是，15名妊娠早期cffDNA含量低于4%的孕妇在妊娠中期cffDNA含量明显升高，远高于4%这一阈值。
讨论
本研究共纳入209名高危孕妇评估NIPT在妊娠早期连续4周内的检测性能。受检孕妇在妊娠早期和妊娠中期均经NIPT检测，阳性孕妇后续进行核型分析确认。结果发现，NIPT在妊娠早期仍可取得与妊娠中期相近的检测精确度和可靠性[3–6]。本研究共检出3例T21，并经妊娠中期NIPT和核型分析确认。其余孕妇在妊娠早期和中期的NIPT检测结果均为阴性，显示NIPT具有很高的检测特异性。若不考虑样本量较小的因素，本研究显示NIPT对T21、T13和45,X的检测灵敏度为100%。此外，妊娠早期NIPT检测结束后自然流产的6名孕妇为T21或T13胎儿，进一步支持NIPT对于T21和T13具有较高的检测灵敏度。不过仍有1例T15在妊娠早期NIPT未检出，怀疑与该孕妇cffDNA含量过低有关。换言之，NIPT检测可能对T15无效，从而造成漏检[3,19,22]。
96名怀有男性胎儿的孕妇cffDNA平均含量在妊娠早期（第8–12孕周）为7.6%，妊娠中期为10.47%。后者与其它研究10–21%的妊娠中期cffDNA含量一致[10,11]。随着孕龄增加，cffDNA含量分布相对随机，揭示纳入本研究的中国孕妇虽然具有相近的体重和人口统计学特征，但人群异质性仍很明显。其中15%样本的cffDNA含量低于T21的检测阈值4%[3,19]，3%样本cffDNA含量低于T18和T13的检测阈值3%[3,19]。若假设男性胎儿和女性胎儿的cffDNA含量相近，则严格意义上讲，NIPT依次不能检出妊娠早期（8-12孕周）15%的T21样本和3%的T18/T13样本。
通过逐个对比96名孕妇的妊娠早期和妊娠中期cffDNA含量变化，我们发现了此前尚未报道的cffDNA含量变化趋势。虽然59%孕妇的cffDNA含量明显升高，与现有理论一致[10,11]，但仍有17%孕妇的cffDNA含量无明显变化，甚至24%孕妇的cffDNA含量下降。在cffDNA含量下降的23名孕妇中，cffDNA含量经过29天和64天分别下降9.91%和13.88%。我们推测其中2名孕妇的cffDNA含量降低与双胎消失综合征有关[23]，而其余则可能与孕期体重剧增而胎盘重量仅平稳增加有关。不过本研究并未对孕期体重进行测量，因而上述推断需进一步数据的支持。我们需要更大样本量的前瞻性临床研究，按照严格的实验设计，多时间点取样，同时记录包括孕期体重增值、胎盘重量增值、胎盘功能和母胎接触面血液流速在内的多种参数，进而才有可能发现影响妊娠初期cffDNA含量变化的关键因素[11]。
本研究发现不同孕妇妊娠早期的cffDNA含量差异显著。约15%孕妇的cffDNA含量低于4%。使得在妊娠早期应用NIPT颇具挑战。初步解决方案是仅当妊娠早期cffDNA含量大于4%时才出具NIPT检测报告，而对于cffDNA含量低于4%的孕妇则被要求在妊娠中期再次接受NIPT检测。另一种更为合理的做法是提高NIPT对于低水平cffDNA的检测敏感度。近期出现的两种方法有望将cffDNA的检测水平降低至4%以下。一是对血浆DNA进行更深度测序，据报道该法已经能够在cffDNA含量为3%时检出T21 [24]。不过相应的检测成本会大大增加。二是利用了胎儿与母体的血浆DNA分子在整体片段大小方面的差异性[25]，借助基于片段大小差异的MPS法，确定cffDNA低水平下的胎儿染色体非整倍体[26]。随着对于低水平cffDNA含量更高灵敏度检测方法的出现，NIPT将会应用于大多数孕妇的妊娠早期检测。
综上，本研究揭示NIPT可用于妊娠早期的染色体非整倍体检测，但低水平cffDNA检测问题尚待解决，临床应用仍需谨慎。不过毫无疑问，随着未来技术的发展，妊娠早期NIPT有望取得与妊娠中期相近的检测灵敏度与精确度，大大缩短诊断结果的等待时间，缓解孕妇及家属的心理压力。
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2020
